自以抗生素為代表的抗菌劑問世以來,細菌對人類健康的危害得到了極大的控制。然而進入21世紀后,情況好似走入了另一個極端——由于抗生素濫用所致的耐藥菌的出現以及廣泛傳播。這是由于在藥物的選擇壓力下,敏感菌株被抑制或殺滅,天然耐藥或獲得性耐藥菌株則繼續生存、繁殖和克隆傳播,導致細菌的耐藥性增高。測序給對抗耐藥菌帶來了新的啟示。


突破傳統耐藥基因組測序缺陷!靶向測序為對抗耐藥菌帶來新方向


細菌的多種耐藥機制由大量耐藥基因所編碼。耐藥菌在基因水平上的改變主要包括固有耐藥性、獲得耐藥性以及多重耐藥性。固有耐藥性來源于細菌本身染色體上的耐藥基因。獲得耐藥性則是由于敏感的細菌發生基因突變或獲得外源性耐藥基因所產生的。多重耐藥性則是指細菌同時對多種不同作用機制,或結構完全各異的抗菌藥物具有耐藥性。當前在全世界范圍內,多種病原菌甚至出現了多重耐藥株,甚至泛耐藥株。


突破傳統耐藥基因組測序缺陷!靶向測序為對抗耐藥菌帶來新方向


圖1. 基因突變與耐藥


但在細菌耐藥形勢愈發嚴峻的今天,培養法仍是病原菌藥敏試驗的主流通用標準,對于臨床常見致病菌,培養法耗時長達24——48小時,對于難培養或生長緩慢的細菌則無能為力。臨床實踐上為了指導“精準用藥”,急需針對細菌耐藥性及其耐藥機制的直接、快速測量技術。


近年來,攜帶NDM-1、MCR-1等耐藥基因的“超級細菌”被不斷發現。隨著分子診斷技術的不斷成熟、應用以及微生物基因檢測產業的快速發展,大量的基因組分析方法被應用于測定微生物基因組序列。例如,“鳥槍法”(Metagenomics Shotgun Sequencing (MSS)),該方法通過將整個基因組打亂,切成隨機碎片,然后測定每個小片段序列,再利用計算機對這些碎片進行排序和組裝,并確定它們在基因組中的正確位置。MSS方法檢測速度快,簡單易行,成本較低,但在檢測低頻率耐藥基因時,MSS缺乏敏感性和特異性。


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圖2. MSS原理


許多研究表明,全基因組測序對于識別基因突變非常重要,但如何保證有效的全基因組覆蓋獲得突變信息,當前除了不斷加深測序深度,靶向捕獲相關基因,后續再測序正在成為新時代的“寵兒”,解決全基因組覆蓋不均一,漏檢等實際問題。當需要測序的基因范圍相對有限時,與全基因組測序相比,有針對性的基因組測序篩選是一種性價比更高的選擇。遺傳病診斷(WES/Panel)、腫瘤伴隨診斷(腫瘤多基因Panel)、免疫治療療效預測(WES/Panel),這些NGS應用熱點都是靶向測序打下的“江山”。2015年,有研究利用基于雜交捕獲的靶向測序技術富集蜱蟲體內的伯氏疏螺旋體基因組,數據有效率在70%以上(Roche SeqCap EZ Choice),揭示了靶向測序在傳染病的病原體鑒定、細菌耐藥譜分析中的巨大潛力。


對于有靶向基因測序技術,更加完整的覆蓋相關基因是提高敏感性及特異性的核心。對于病原體鑒定而言,要求所靶向的基因不但要與固有耐藥性相關(包括對抗生素、重金屬、農藥的耐藥基因),還要包括獲得性耐藥相關基因。自2005年起,多種Antibiotic Resistance(AR)基因庫相繼出現,包括Antibiotic Resistance Genes Online (ARGO), Antibiotic Resistance Genes Database (ARDB), Resfinder, Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)等等。其中,除了ResFinder 和 CARD以外,其他幾種數據庫并未進行全面而規律的更新。CARD數據庫于2013年發布,以Antibiotic Resistance Ontology(ARO)為分類單位的形式所構建,其中ARO用于關聯抗生素模塊及其目標、抗性機制、基因變異等信息。ResFinder數據庫的構建則是基于對whole genome studies (WGS) data的利用。但這些數據庫并不支持檢測基因點突變。ARG-ANNOT 是第一個可以檢測與耐藥性相關的基因點突變的數據庫。


2016年11月29日,國內首款病原微生物基因檢測軟件獲得藥監局批文,進入臨床應用。此后,國內數家企業開始布局NGS微生物基因檢測。但這些用于病原體檢測的靶向測序技術,僅包含以上AR數據庫中的小部分數據,未能完整覆蓋相關基因。SeqCap EZ ResCap Design突破了耐藥傳統基因組測序的缺陷,其靶向的基因包括來源于Arg-ANNOT, CARD, ResFinder, Bacmet, RED-DB等基因庫的7,963 個耐抗菌素的相關基因片段,以及704個耐重金屬及農藥的相關基因片段。此外,SeqCap EZ ResCap Design同樣包括了2517個來源于ConjDB數據庫的釋放酶基因(釋放酶是一種遺傳元件介導的獲得性耐藥的預測因子),這使得該產品在保證檢測速度的同時,更加完整地覆蓋了病原體檢測相關的基因。羅氏素以其在探針設計上的精湛算法著稱,獨有的算法使得目標區域中的更多堿基序列可以直接設計探針,從而保證了目標區域的更高覆蓋。


突破傳統耐藥基因組測序缺陷!靶向測序為對抗耐藥菌帶來新方向


圖3. Number of detected genes by unequivocally mapped reads per Million of Reads.1


自上世紀90年代初,學界開始涉足“人類基因組計劃”。近年來,基因測序從實驗室走入臨床,甚至逐漸成為全球醫學界熱門的話題。隨著DNA測序技術的迅速發展, 其已經在流行病學診斷和藥物敏感性預測等方面得到廣泛應用, 研究對象也由簡單的單個或幾個基因及其作用轉為全基因組的結構和功能。有數據顯示,臨床微生物檢測的市場空間將達到400億元。2015年,全球范圍內微生物檢測占IVD行業份額為18%,僅次于POCT。全基因組測序技術能夠分析得到耐藥基因及其突變情況, 除了已知的耐藥機制, 還可用于預測未知的潛在耐藥機制,。但是由于高成本的不足,使得全基因組測序在臨床上的應用極為受限,因此,有針對性的基因組測序篩選是一種性價比更高的選擇。基因組測序技術未來或將超越常規方法,成為耐藥性研究的首選工具之一, 更加廣泛地應用到疾病的診斷及治療中。


關于全基因組測序


全基因組測序是對未知基因組序列的物種進行個體的基因組測序。 1986年, Renato Dulbecco是最早提出人類基因組測序的科學家之一。

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